Avaliação da estabilidade físico-química e biológica de plasmídeos com potencial biotecnológico

Studies involving plasmid stability have started for at least two decades and have been growing in recent years, since pDNAs have had enormous potential as vectors in gene therapy, however the therapeutic use of these vectors has been hampered by stability issues, especially in Refers to the process...

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Detalhes bibliográficos
Autor principal: Monte, Jéssyka Fernanda Santiago
Outros Autores: Silva, Marcelo de Sousa da
Formato: Dissertação
Idioma:por
Publicado em: Brasil
Assuntos:
Plasmídeo
Degradação
Estabilidade
Nucleases
Terapia gênica
CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
Endereço do item:https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23716
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Monte, Jéssyka Fernanda Santiago
Avaliação da estabilidade físico-química e biológica de plasmídeos com potencial biotecnológico
description Studies involving plasmid stability have started for at least two decades and have been growing in recent years, since pDNAs have had enormous potential as vectors in gene therapy, however the therapeutic use of these vectors has been hampered by stability issues, especially in Refers to the process of production and purification, storage for long periods and being susceptible to degradation by nucleases. Thus, assays that allow the analysis of this degradation process can be important tools for its understanding, associated to other variables, such as temperature, storage time, pDNA size and nucleoside action. The competent E. coli DH5-α was produced, transformed with the pDNAs studied (pVAX1, pVAX1lacZ and MSPpVAX1), purified and stored at different temperatures for a predetermined time and to establish a relationship between the stability of the different pDNAs and their Biological function as vectors, the resistance of the supercoiled isoform to the action of serum nucleases at different concentrations and over time was studied. For this purpose, agarose gel electrophoresis and transformation in E. coli with calculation of cell transformation efficiency were performed. It was observed over time that the integrity of the supercoiled pDNA was lost as a function of time and storage temperature, in addition, pDNAs containing only prokaryotic sequences proved to be more resistant to these factors when compared to that having procaryotic sequence pDNA, showing that these factors influence the stability of pDNA. In relation to the nuclease action, the bigger plasmid was more affected by the activity of these enzymes. Regarding biological function, transformation efficiency assays in E. coli indicated that there was a higher percentage of transformed cells when plasmid was used in the supercoiled conformation. It was verified in all the tests that the supercoiled isoform was always more efficient than the other isoforms, possibly due to its greater cytoplasmic stability and the faster diffusion of this isoform towards the nucleus. Thus, this work showed the degradation kinetics, step by step, of the studied pDNAs, showing that the loss of supercoiled form compromises the stability of the pDNAs, thus affecting the biological function of the same, compromising their use in gene therapy and vaccines DNA.
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Thus, assays that allow the analysis of this degradation process can be important tools for its understanding, associated to other variables, such as temperature, storage time, pDNA size and nucleoside action. The competent E. coli DH5-α was produced, transformed with the pDNAs studied (pVAX1, pVAX1lacZ and MSPpVAX1), purified and stored at different temperatures for a predetermined time and to establish a relationship between the stability of the different pDNAs and their Biological function as vectors, the resistance of the supercoiled isoform to the action of serum nucleases at different concentrations and over time was studied. For this purpose, agarose gel electrophoresis and transformation in E. coli with calculation of cell transformation efficiency were performed. It was observed over time that the integrity of the supercoiled pDNA was lost as a function of time and storage temperature, in addition, pDNAs containing only prokaryotic sequences proved to be more resistant to these factors when compared to that having procaryotic sequence pDNA, showing that these factors influence the stability of pDNA. In relation to the nuclease action, the bigger plasmid was more affected by the activity of these enzymes. Regarding biological function, transformation efficiency assays in E. coli indicated that there was a higher percentage of transformed cells when plasmid was used in the supercoiled conformation. It was verified in all the tests that the supercoiled isoform was always more efficient than the other isoforms, possibly due to its greater cytoplasmic stability and the faster diffusion of this isoform towards the nucleus. Thus, this work showed the degradation kinetics, step by step, of the studied pDNAs, showing that the loss of supercoiled form compromises the stability of the pDNAs, thus affecting the biological function of the same, compromising their use in gene therapy and vaccines DNA. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Estudos envolvendo estabilidade de plasmídeos tiveram início há pelo menos duas décadas e vem crescendo nos últimos anos, desde que os pDNAs apresentaram um enorme potencial como vetores em terapia gênica. O uso terapêutico desses vetores tem sido dificultado por questões de estabilidade, principalmente no que se refere ao processo de produção e purificação, armazenamento por longos períodos e serem susceptíveis à degradação por nucleases. Assim, ensaios que permitam analisar estes processos que levam a instabilidade do pDNA podem ser ferramentas importantes para sua compreensão, associado a outras variáveis, tais como temperaturas, tempo de armazenamento, tamanho do pDNA, presença de sequências procarióticas e ação nucleásica, assim E. coli DH5-α competente foi produzida, transformada com os pDNAs estudados (pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1), purificados e armazenados em diferentes temperaturas por um intervalo de tempo pré-determinado e para estabelecer uma relação entre a estabilidade dos diferentes pDNAs e sua função biológica enquanto vetores, estudou-se a resistência da isoforma super-enrolada à ação da nucleases de soro em diferentes concentrações e ao longo do tempo. Para tal, eletroforese em gel de agarose e transformação em E. coli com cálculo da eficiência de transformação celular foram realizados. Foi observado ao longo do tempo que a integridade do pDNA super-enrolado foi perdida em função do tempo e da temperatura de armazenamento, além disso, os pDNAs contendo sequências apenas procarióticas se mostraram mais resistente a esses fatores quando comparado ao que possuía sequência procariótica, mostrando que há influência desses fatores na estabilidade do pDNA. Em relação à ação nucleásica, o maior plasmídeo foi mais acometido pela atividade dessas enzimas. Quanto a função biológica, os ensaios de eficiência de transformação em E. coli indicaram que houve uma maior percentagem de células transformadas quando era utilizado plasmídeo na conformação super-enrolada. Verificou-se em todos os ensaios, que a isoforma super-enrolada era sempre mais eficiente que as demais isoformas, devendo-se esse fato possivelmente à sua maior estabilidade citoplasmática e a difusão mais rápida desta isoforma em direção ao núcleo. Assim esse trabalho mostrou a cinética de degradação, passo a passo, dos pDNAs estudados, mostrando que a perda da forma super-enrolada compromete a estabilidade dos pDNAs, afetando dessa forma a função biológica dos mesmos, comprometendo sua utilização em terapia gênica e vacinas de DNA. 2017-08-07T15:09:24Z 2017-08-07T15:09:24Z 2017-05-29 masterThesis MONTE, Jéssyka Fernanda Santiago. Avaliação da estabilidade físico-química e biológica de plasmídeos com potencial biotecnológico. 2017. 72f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2017. https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23716 por Acesso Aberto application/pdf Brasil UFRN PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

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