Influência da heparina no canal formado pela alfa-toxina do Staphylococcus aureus em bicamadas lipídicas planas/
Resumo:A alfa-toxina, uma proteína produzida por Staphylococcus aureus. é capaz de formar canais aquosos em membranas biológicas e bicamadas lipídicas. Esse tipo de canal, dependendo das condições experimentais, apresenta um "gating" com alta sensibilidade a voltagem. Devido a esse fato e...
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| Resumo: | Resumo:A alfa-toxina, uma proteína produzida por Staphylococcus aureus. é capaz de formar canais aquosos em membranas biológicas e bicamadas lipídicas. Esse tipo de canal, dependendo das condições experimentais, apresenta um "gating" com alta sensibilidade a voltagem. Devido a esse fato e à facilidade na sua obtenção, em relação aos canais de tecidos excitáveis, a alfa-toxina, incorporada em bicamadas lipídicas planas, foi utilizada neste trabalho como um sistema modelo para se estudar a influência da heparina e outros poliânions sobre a cinética dos canais iônicos. Tais estudos poderão tanto auxiliar a compreensão do mecanismo de regulação dos canais iônicos, como elucidar o papel da constituição lipídica da membrana sobre essa regulação. Foram realizados experimentos de fixação de voltagem para análise das correntes iônicas macroscópicas e microscópicas, e os resultados obtidos mostraram que ação da heparina e dos outros poliânios sobre a cinética dos canais de alfa-toxina são dependente, tanto da concentração quanto dos pesos moleculares desses poliânions. As curvas "dose-efeito" foram analisadas com o auxílio da equação do HiII, cujos coeficientes foram sempre maiores que um, o que indica a presença de pelo menos dois sítios de interação da heparina com o canal iônico incorporado na bicamada lipídica. Possivelmente, um desses sítios hipotéticos pode ser a bicamada lipídica ou, mais especificamente, a cabeça polar dos fosfolipídios. Também foram realizados experimentos com bicamadas formadas de diferentes tipos de lipídios, visando investigar o papel da composição lipídica sobre a cinética dos canais. Os resultados mostraram que os lipídios influenciaram a ação dos poliânions (e da heparina em particular) sobre a cinética dos canais iônicos, de tal maneira que a diferença entre os C50 em diferentes membranas pode chegar a mais de cem vezes.#$&Os resultados mostraram a ausência de qualquer correlação entre o efeito da heparina sobre os canais formados pela alfatoxina e a carga superficial ou cabeça polar dos fosfolipídios das membranas. Daí cabe perguntar: Que fator da composição lipídica da membrana determina a sensibilidade do canal aos poliânions? Para responder a esta questão, analisouse a correlação entre a composição dos ácidos graxos dos fosfolipídios e o C50 da atividade da heparina 6000 Da. Observou-se uma correlação positiva entre o C50 e a quantidade de ácidos graxos não saturados e uma correlação negativa entre o C50 e a razão entre quantidade de ácidos graxos saturados e não saturados. Um coeficiente de correlação maior do que 0.9 foi estabelecido para a relação entre o C50 e a quantidade de ácidos graxos longos (C ≥20). Concluindo que a saturação e o comprimento da cadeia carbônica dos ácidos graxos influenciaram no efeito da heparina sobre a cinética dos canais iônicos. Esses dois fatores parecem influir indiretamente, através de modificações nas propriedades da membrana. Os resultados realizados em experimentos com canal unitário demonstraram que a heparina não altera, significativamente, o ruído e a condutância do canal em qualquer voltagem aplicada (± 200 mV) à membrana. O canal se fecha de maneira "tudo ou nada". Isso significa que a heparina parece não atravessar o canal. Para esclarecer os processos moleculares envolvidos na interação dos poliânions com o canal iônico, utilizaram-se mutantes da alfa-toxina, com a cisteína introduzida em sua molécula, de maneira que esse aminoácido ficasse perto de uma das bocas do canal. Desta maneira, pôde-se estabelecer que a presença de uma carga negativa diminui o efeito da heparina. Isto ocorre, provavelmente, devido à repulsão eletrostática entre as cargas negativas introduzidas no canal e a molécula de heparina.#$&Por outro lado, a incorporação de uma carga positiva ao canal atrai a molécula de heparina aumentando o seu efeito. Essas experiências revelaram que a heparina interage, pelo menos, com a boca do canal.#$&Abstract:Alpha toxin is one of the important toxins produced by Staphylococcus aureus. It is a single-chain protein that is able to bind with lipid bilayer of membranes and build a heptameric anion-selective water pore - ion channel. This channel possesses sensitivity to transmembrane voltage, which facilitates the channel transition between high conductance and low conductance states. At some conditions this transition can be as rapid as those observed in excitable biomembranes. Because of these characteristics and reIative facility in purification, channels formed by S. aureus alpha-toxin in planar lipid bilayer was chosen as a system modeling the voltage-gated channels of biological membranes and was utilized to study the influence of polyanions (heparin and dextran sulfate) on the kinetic properties of ion channels. The role of both the molecular weight of polyanions and the lipid composition of bilayer was investigated. Experiments with multíchannel bilayers formed from eggs phosphatitylcholine demonstrated that effectivity of polyanions depends on their structure and (at higher extend) their molecular weight. The Hill-coefficient for "dose-effect" curves is generally larger than 1. It points out on the existence of at least two sites of polyanion binding with the system "ion channel-lipid bilayer". It could be hypothizated that polar heads of phospholipids and íon channel itself may contein such sites. These results suggest that beside molecular mass other factors such as the charge density and the charge distribution, could participate in determination of the effectivity of polyanions.#$&The second set of experiments was done with ion channels incorporated into bilayers with different lipid composition. It was found that the activity of a polyanion strongly depends on type of lipids in bilayers. So C50 obtained for Hep6000 action against ST-channels incorporated in phosphatidylcholine (PC eggs) bilayers was more than 100 times less than C50. Results show the absence a correlation between the heparin effectivity and type of polar head of lipids in bilayers. To find parameters of lipids that are responsible for modulation of heparin 6000 actions against ST channels the correlation analysis between C50 and fatty acid composition of lipids (taken from manufacture, Avanti Polar Lipids) was done. It was established that there is a significant (~0.7) positive correlation between C50 and quantity of unsaturated fatty acid. Clearly negative correlation was observed with the saturated/unsaturated index. Larger correlation coefficient (~0.9) was found with quantity of the long fatty acids chains (C ≥20). Hence, it appears that the degree of saturation and the quantity of the long fatty acids chains are two main membrane factors modulating the heparin effectivity against ion channels. These factors seem influence by indirect way, via modulation of bilayer properties. To investigate a possible direct ion channel - pOlyanions interaction, experiments with ion channels formed by mutant molecules of alpha-toxin were carried out. Wild ST does not contain cystein - aminoacid that can be easily modified with various highly specific reagents. Using such modified channels we found that the presence of negative charge at the opening decreased while the presence of positive charge augmented the heparin effects due it repelling or attraction by openings. Results appear to reveal the direct interaction heparin with the protein part of ion channel structure.#$&Experiments at the single channel levei demonstrate that neither conductance nor current noise is changed in the presence of heparin at any voltage applied (±200 mV). Findings point out that heparin does not pass through the channel. The channel transition to low conductance state happens by manner "Ali or Nothing". Hence, there is a high probability that heparin during it direct interaction with the protein part of the system "ion channel-lipid bilayer" closes the channel acting as a lid. |
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