Ensaio de obtenção de plantas transgênicas de Nicotina tabacum contendo promotores de tiorredoxinas h de Arabidopsis thaliana /
Resumo: Tiorredoxinas são enzimas termo estáveis de aproximadamente 14 kDa, presentes em todos os organismos, e responsáveis por diversas funções na célula. Elas apresentam um sítio ativo característico (x=G ou P) responsável por sua função como doadora de hidrog6enios. Nos vegetrais, três tipos de...
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| Formato: | Dissertação |
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| Resumo: | Resumo: Tiorredoxinas são enzimas termo estáveis de aproximadamente 14 kDa, presentes em todos os organismos, e responsáveis por diversas funções na célula. Elas apresentam um sítio ativo característico (x=G ou P) responsável por sua função como doadora de hidrog6enios. Nos vegetrais, três tipos de tiorredoxinas são encontradas e responsáveis por funções variadas na célula. As do tipo m e f localizam-se nos cloroplastos e participam da ativiação de enzimas da fotossíntese. O terceiro tipo compreende as tiorredoxinas heterólogas, chamadas de h, que são encontradas no citoplasma e constituem o tema básico nesta dissertação de mestrado. Experimentos anteriormente realizados com gene repórter gus, fusionado aos cinco promotores dos genes de tiorredoxinas h de Adabidopsis thaliana contribuíram para a caracterização funcional desses genes através de estudos histoquímicos. Neste trabalho, plantas transgênicas de tabaco foram obtidas com as construções utilizadas em Arabidopsis para observar se o spromotores funcionam usando a maquinaria de Nicotiana. Através da aplicação de um protocolo clássico de transformação de discos de folha, foram obtidas 11 plantas transgênicas com promotor do gene TRX2, 6 plantas com promotor TRX3 e 9 plantas com promotor TRX5. Estes regenerantes primários foram cultivados in vitro inicialmente e, posteriormente, em casa de vegetação até a obtenção de sementes. A expressão do gene repórter gus, regulado por estes promotores, foi estudada nos regenerantes primários e em plântulas da geração F1, por meio de detecção histoquímica. A detecção do gus foi positiva para as plantas com os promotores TRX2, TRX3 e TRX5. Observou-se semelhanças e diferenças quanto aos padrões de localização histoquímica comparativos entre o tabaco e Arabidopsis. Todas as plantas apresentam expressão do gus nas folhas, o que reproduz os resultados de Arabidopsis.#$&As plantas TRX5 apresentam a expressão gênica que mais se assemelha ao que foi observado em Arabidopsis. Estas mostraram expressão ao nível da raiz, caule e tecidos vasculares da folha. As plantas com promotores de TRX2 e TRX3 apresentaram expressão divergente, mostrando ausência do gene repórter na raiz. O gene gus foi detectado no caule para a planta TRX2, o que constitui uma diferença importante em relação ao que fora visto em Arabidopsis, onde não há registro desta expressão.#$&Abstract : Thioredoxins are thermolabel oxidoreductases of approximately 14 kDa, ubiquitous, and responsable for many functions in cells. These enzymes presents a characteristic active site WCxPC (x=G or P) which acts as a hydrogen donnor. In plants, three types of thioredoxins are found and called m, f and h. m and f thioredoxins are chloroplastic enzymes and have specific functions activating other enzymes from photosynthesis pathway. The third type, heterologous thioredoxins, is cytoplasmatics and constitutes the interest of this work. In a precedent study, histochemical detection of gus reporter gene fusioned to the 5 promoters of Arabidopsis thaliana h thioredoxins has contributed to increase the functional analysis of these proteins. In our work, tobacco transgenic plants have been transformed with the Arabidopsis constructs to confirm if tobacco transcriptional and translational system could be functional as in Arabidopsis. We have emplyed a classical Agrobacterium leaf disc transformation protocol, which has allowed the obtention of 11 plants for TRX2 promoter construct, 6 for TRX3 promoter construct and 9 plants for TRX5 promoter construct. These regenerants were in vitro cultivated and transferred to greenhouse to produce seeds. The expression of gus gene has been then analyzed in these regenerants and F1 plantlets by a classical histochemical gus assay. The detection of gus was positive for TRX2, TRX3 and TRX5 promoter constructs. The expression pattern has presented differences and similarities between tobacco and Arabidopsis. All plants present gus expression in leaves, which repeats the Arabidopsis results. TRX5 plants present the same responces observed in Arabidopsis showing gus detection in leaves, stem and roots. TRX2 and TRX3 constructs have produced a different result because they lack a root expression. Also, in tobacco TRX2 plants a stem gus detection has been noted, which is an important difference in relation to Arabidopsis. |
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