Genetically encoded calcium and voltage indicators in the detection of action potentials and synaptic inputs in cultured hippocampal neurons/
Resumo: Por décadas o imageamento óptico se mostrou uma técnica muito poderosa no estudo da atividade de neurônios, tanto in vitro como no cérebro intacto. Recentemente, indicadores ópticos codificados geneticamente surgiram como ferramentas de alta resolução espacial e temporal não-invasivos, uti...
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| Principais autores: | , , , |
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| Formato: | Dissertação |
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| Assuntos: | |
| Endereço do item: | http://repositorio.ufrn.br:8080/jspui/handle/123456789/17026 |
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| Resumo: | Resumo:
Por décadas o imageamento óptico se mostrou uma técnica muito poderosa no estudo da atividade de neurônios, tanto in vitro como no cérebro intacto. Recentemente, indicadores ópticos codificados geneticamente surgiram como ferramentas de alta resolução espacial e temporal não-invasivos, utilizados para o monitoramento da atividade de neurônios individuais e de populações neuronais específicas. Tais indicadores optogenéticos são basicamente compostos por duas proteínas. A primeira atua como um biosensor que detecta alteraҫões referentes a um sinal fisiológico específico (como por exemplo concentraҫão de Ca2+, voltagem ou pH), sendo portanto o segmento que determina a sensibilidade da proteína-repórter. A segunda porҫão dos indicadores é por sua vez uma proteína fluorescente, que converte os sinais fisiológicos detectados em variações na emissão de fluorescência.O rápido aumento do número de novos indicadores optogenéticos, juntamente com a ausência de comparações desses indicadores sob condições idênticas gerou a dificuldade de escolher a proteína mais adequada, a depender do desenho experimental em questão. A proposta do nosso estudo foi comparar três proteínas-repórter recentemente desenvolvidas: os indicadores de cálcio GCaMP3 e R-GECO1 e o indicador de voltagem VSFP butterfly1.2.
Eles foram expressos em neurônios hipocampais em cultura, os quais foram submetidos às técnicas de patch-clamp e imageamento óptico. Após experimentos, algumas culturas foram fixadas e marcadas para sinapsina-1 e MAP2, demonstrando maturidade neuronal. Os três grupos (cada um expressando uma das proteínas) exibiram valores de potencial de membrana semelhantes (in mV GCaMP3: -56 ±8.0; R-GECO1: -57 ±2.5; VSFP: -60 ±3.9; p = 0,86); todavia, o grupo de neurônios expressando VSFP apresentou valor médio de resistência de input inferior aos demais grupos (in Mohms, GCaMP3: 161 ±18.3; R-GECO1: 128 ±15.3; VSFP: 94 ±14.0; p = 0,02). Cada neurônio foi submetido a protocolos de injeҫão de correntes em diferentes frequências (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1,5 Hz e 0,7 Hz) e registramos seu efeito sobre a emissão de fluorescência no tempo. Em nosso estudo, apenas 26,7% (4/15) dos neurônios expressando VSFP apresentaram sinal de fluorescência detectável em resposta a potenciais de aҫão. O valor médio da relaҫão sinal-ruído (SNR) obtido em resposta a cinco disparos (10 Hz) foi pequeno (1.3 ±0,21), porém a cinética rápida daVSFP permitiu a discriminaҫão de potenciais de aҫão como picos individuais, permitindo a detecҫão de 53% dos disparos evocados. Frequências inferiores a 5 Hz e sinais subliminares foram indetectáveis devido ao alto ruído. Por sua vez, os indicadores de cálcio mostraram a maior mudança na fluorescência após o mesmo protocolo (cinco disparos a 10 Hz). Dos neurônios expressando GCaMP3, 80% (8/10) exibiram sinal, com valor médio de SNR 21 ±6,69 (soma), enquanto para R-GECO1, 50% (2/4) dos neurônios possuíam sinal, com valor médio de SNR 52 ±19,7 (soma). Para a frequência de 10 Hz, foram detectados 54% dos disparos com GCaMP3 e 85% com R-GECO1. Potenciais de aҫão foram detectáveis nas frequências analisadas and foi detectado sinal de fluorescência também de despolarizaҫões subliminares.
Pelo fato de GCaMP3 apresentar maior probabilidade de obtenҫão de sinal, bem como alto SNR, alguns experimentos foram realizados somente com essa proteína. Demonstramos que GCaMP3 é eficaz na detecҫão da entrada de inputs sinápticos (envolvendo influxo de Ca2+), com alta resoluҫão espacial e temporal. Observamos também diferenҫas entre o sinal decorrente de disparos evocados e de disparos ocorrendo espontaneamente. Nos registros em grupos celulares, GCaMP3 mostrou clara discriminaҫão entre células ativadas e em silêncio, bem como se revela uma ferramenta em potencial nos estudos de sicronizaҫão neuronal. Assim, nossos resultados indicam que os indicadores de cálcio atuais já permitem a execuҫão de estudos minuciosos de comunicaҫão neuronal, incluindo desde espinas dendríticas individuais até a alternativa de investigar eventos de sincronia em redes neuronais geneticamente definidas. Em contrapartida, embora ainda em aprimoramento, estudos com VSFPs representam uma tecnologia promissora para o monitoramento de atividade neural e poderá ser futuramente mais adequado do que os indicadores de cálcio, uma vez que neurônios trabalham em uma escala de tempo mais veloz do que eventos de cálcio podem prever.
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