Um novo inibidor de tripsina multifuncional de sementes de Erythrina velutina: caracterização e propriedades farmacológicas /
Resumo: A sepse é uma doença complexa, de alta gravidade e durante o seu desenvolvimento pode ocorrer eventos inflamatórios graves, que podem levar o paciente ao óbito. Inibidores de peptidases isolados de sementes de leguminosas estão sendo estudados devido suas variadas atividades biomédicas ou fa...
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Anti-inflamatórios - Dissertação. Atividades multifuncionais - Dissertação. Inibidor de tripsina - Erythrina velutina(EvTIb) - Dissertação. Multifunctional activities of trypsin inhibitors. Erythrina velutina. |
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Anti-inflamatórios - Dissertação. Atividades multifuncionais - Dissertação. Inibidor de tripsina - Erythrina velutina(EvTIb) - Dissertação. Multifunctional activities of trypsin inhibitors. Erythrina velutina. Machado, Richele Janaína de Araújo. Santos, Elizeu Antunes dos. Morais, Ana Heloneida de Araújo. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Um novo inibidor de tripsina multifuncional de sementes de Erythrina velutina: caracterização e propriedades farmacológicas / |
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Resumo: A sepse é uma doença complexa, de alta gravidade e durante o seu desenvolvimento pode ocorrer eventos inflamatórios graves, que podem levar o paciente ao óbito. Inibidores de peptidases isolados de sementes de leguminosas estão sendo estudados devido suas variadas atividades biomédicas ou farmacológicas. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na avaliação das atividades multifuncionais do inibidor de tripsina presente nas sementes de Erythrina velutina (EvTIb). Dois inibidores de tripsina foram purificados por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em tripsina-sepharose e cromatografia de fase reversa. Os inibidores purificados foram denominados de EvTIa e EvTIb e suas massas moleculares determinadas por espectrometria de massa por electrospray (ESI) foram: 19.228,16 Da e 19.210,48 Da, respectivamente. Dentre eles, o EvTIb apresentou maior atividade específica para tripsina e maior percentual de rendimento de extração, sendo, portanto, o escolhido para as análises adicionais. Os fragmentos desse inibidor gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram analisados por espectrometria de massa MALDI-ToF-ToF, permitindo elucidar sua estrutura primária parcial. O EvTIb exibiu uma atividade de inibição do tipo não-competitiva para a tripsina com IC50 de 22 nmol.L-1 e constante de inibição (Ki) de 10 nmol.L-1. Além da atividade de inibição para tripsina, EvTIb também inibiu o fator Xa e a elastase neutrofílica, porém não inibiu trombina, quimotripsina ou peptidase 3. EvTIb se manteve estável a variação de pH e temperatura. EvTIb não foi citotóxico e não inibiu o crescimento bacteriano de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. EvTIb foi capaz de prolongar o tempo de coagulação de maneira dose-dependente. Finalmente, observou-se que EvTIb foi capaz de restabelecer os níveis hemostáticos, inibir a migração leucocitária em camundongos sépticos e diminuir a secreção de TNF-a e não teve ação sobre a liberação de IL-6. Por outro lado, EvTIb promoveu um aumento na liberação de IFN- a e IL-12. Esses dados sugerem que EvTIb pode constituir em uma nova molécula com potencial de uso no tratamento da sepse e doenças relacionadas à coagulação.#$&Sepsis is a highly severe and complex disease and during its development can occur severe inflammatory events, which may cause the patient's death. Inhibitors of peptidases isolated from legume seeds are being studied because of its varied biomedical or pharmacological activities. In this sense, the present study was to assess the activities of the multifunctional trypsin inhibitor present in the seeds of Erythrina velutina (EvTIb). Two trypsin inhibitors were purified by fractionation with ammonium sulphate (30-60%), Trypsin-Sepharose affinity chromatography and reversed-phase liquid chromatography. The purified trypsin inhibitors were named as EvTIa and EvTIb and their molecular masses determined by electrospray mass spectrometry were of 19228.16 Da and 19210.48 Da, respectively. Among them, EvTIb showed higher specific activity for trypsin and a higher percentage of extraction yield, therefore, chosen for further analysis. Inhibitor fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed by mass spectrometry MALDI-ToF-ToF, allowing partially elucidate its primary structure. Inhibition curve, of trypsin with EvTIb provided an IC50 value of about 22 nmol.L-1 and Dixon plot showed an inhibition constant of 10 nmol.L-1 for trypsin in a non-competitive inhibition mechanism. In addition to inhibiting the activity of trypsin, EvTIb also inhibited factor Xa and neutrophil elastase, but did not inhibit thrombin, chymotrypsin or peptidase 3. EvTIb remained stable at varying pH and temperature. EvTIb was not cytotoxic and did not inhibit bacterial growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus. EvTIb was able to prolong the clotting time in a dose-dependent way. Finally, it was observed that EvTIb was able to restore the hemostatic levels, to inhibit leukocyte migration in septic mice and to decrease the secretion of TNF-α and had no action on the release of IL-6. Moreover, EvTIb promoted an increase in the release of IFN-α and IL-12. These data suggested that EvTIb may constitute a novel and potent molecule with potential use in the treatment of sepsis and diseases related to coagulation. |
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Machado, Richele Janaína de Araújo. Santos, Elizeu Antunes dos. Morais, Ana Heloneida de Araújo. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. |
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Nesse sentido, o presente estudo consistiu na avaliação das atividades multifuncionais do inibidor de tripsina presente nas sementes de Erythrina velutina (EvTIb). Dois inibidores de tripsina foram purificados por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em tripsina-sepharose e cromatografia de fase reversa. Os inibidores purificados foram denominados de EvTIa e EvTIb e suas massas moleculares determinadas por espectrometria de massa por electrospray (ESI) foram: 19.228,16 Da e 19.210,48 Da, respectivamente. Dentre eles, o EvTIb apresentou maior atividade específica para tripsina e maior percentual de rendimento de extração, sendo, portanto, o escolhido para as análises adicionais. Os fragmentos desse inibidor gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram analisados por espectrometria de massa MALDI-ToF-ToF, permitindo elucidar sua estrutura primária parcial. O EvTIb exibiu uma atividade de inibição do tipo não-competitiva para a tripsina com IC50 de 22 nmol.L-1 e constante de inibição (Ki) de 10 nmol.L-1. Além da atividade de inibição para tripsina, EvTIb também inibiu o fator Xa e a elastase neutrofílica, porém não inibiu trombina, quimotripsina ou peptidase 3. EvTIb se manteve estável a variação de pH e temperatura. EvTIb não foi citotóxico e não inibiu o crescimento bacteriano de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. EvTIb foi capaz de prolongar o tempo de coagulação de maneira dose-dependente. Finalmente, observou-se que EvTIb foi capaz de restabelecer os níveis hemostáticos, inibir a migração leucocitária em camundongos sépticos e diminuir a secreção de TNF-a e não teve ação sobre a liberação de IL-6. Por outro lado, EvTIb promoveu um aumento na liberação de IFN- a e IL-12. Esses dados sugerem que EvTIb pode constituir em uma nova molécula com potencial de uso no tratamento da sepse e doenças relacionadas à coagulação.#$&Sepsis is a highly severe and complex disease and during its development can occur severe inflammatory events, which may cause the patient's death. Inhibitors of peptidases isolated from legume seeds are being studied because of its varied biomedical or pharmacological activities. In this sense, the present study was to assess the activities of the multifunctional trypsin inhibitor present in the seeds of Erythrina velutina (EvTIb). Two trypsin inhibitors were purified by fractionation with ammonium sulphate (30-60%), Trypsin-Sepharose affinity chromatography and reversed-phase liquid chromatography. The purified trypsin inhibitors were named as EvTIa and EvTIb and their molecular masses determined by electrospray mass spectrometry were of 19228.16 Da and 19210.48 Da, respectively. Among them, EvTIb showed higher specific activity for trypsin and a higher percentage of extraction yield, therefore, chosen for further analysis. Inhibitor fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed by mass spectrometry MALDI-ToF-ToF, allowing partially elucidate its primary structure. Inhibition curve, of trypsin with EvTIb provided an IC50 value of about 22 nmol.L-1 and Dixon plot showed an inhibition constant of 10 nmol.L-1 for trypsin in a non-competitive inhibition mechanism. In addition to inhibiting the activity of trypsin, EvTIb also inhibited factor Xa and neutrophil elastase, but did not inhibit thrombin, chymotrypsin or peptidase 3. EvTIb remained stable at varying pH and temperature. EvTIb was not cytotoxic and did not inhibit bacterial growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus. EvTIb was able to prolong the clotting time in a dose-dependent way. Finally, it was observed that EvTIb was able to restore the hemostatic levels, to inhibit leukocyte migration in septic mice and to decrease the secretion of TNF-α and had no action on the release of IL-6. Moreover, EvTIb promoted an increase in the release of IFN-α and IL-12. These data suggested that EvTIb may constitute a novel and potent molecule with potential use in the treatment of sepsis and diseases related to coagulation. 3 2022-10-06T07:05:06Z 2022-10-06T07:05:06Z 2012. Dissertação 615.276 M149c DISSERT 193406 http://repositorio.ufrn.br:8080/jspui/handle/123456789/12596 https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/12596/1/NovoInibidorTripsina_Machado_2012.pdf |